Mednarodna skupina znanstvenikov iz ZDA, Francije in Kitajske je ustvarila polsintetično obliko življenja. Čeprav so že poskušali pridobiti bakterije s spremenjeno DNK, so se mikroorganizmi slabo razmnoževali, zahtevali posebne rastne pogoje in se sčasoma znebili sprememb, ki so bile v njih uvedene. "Lenta.ru" govori o novem delu, v katerem so raziskovalci uspeli rešiti te težave, saj so dobili bitje, ki se močno razlikuje od naravnega življenja na Zemlji.
V zadnjem času je bila DNA vseh živih organizmov na našem planetu sestavljena iz štirih vrst nukleotidov, ki vsebujejo adenin (A), timin (T) ali gvanin (G) ali citozin ©. Strune deset ali sto milijonov nukleotidov tvorijo ločene kromosome. Geni, najdeni na kromosomih, so v bistvu dolga nukleotidna zaporedja, v katerih so kodirana aminokislinska zaporedja proteinov. Kombinacija treh zaporednih nukleotidov (kodon ali triplet) ustreza eni od 20 aminokislin. Tako življenje uporablja tričrkovno genetsko kodo (ATG, CGC itd.), Ki temelji na štirimestni abecedi (A, C, T, G).
Ko celica organizma potrebuje beljakovino (polipeptid), se vklopi gen, ki ga kodira. Slednja je vezana na poseben encim, imenovan RNA polimeraza, ki med procesom transkripcije začne slediti zaporedju nukleotidov in mu ustvarja kopijo v obliki molekule, imenovane messenger RNA (mRNA). RNA je zelo podobna DNA, vendar namesto timina vsebuje uracil (U). Po tem mRNA zapusti celično jedro in se usmeri v ribosome, kjer med postopkom prevajanja služi kot recept za ustvarjanje aminokislinske verige beljakovin.
Raziskovalci so se odločili spremeniti genetsko kodo Escherichia coli, tako da so ji dodali dve dodatni "črki". Dejstvo je, da je DNK v živih organizmih dvojna, to je, tvorijo jo dve verigi, ki sta med seboj povezani z komplementarnimi vezmi. Takšne vezi se tvorijo med bazo A-nukleotida iz ene verige in bazo T-nukleotida iz druge (podobno med C in G). Zato morata biti tudi nova sintetična nukleotida sposobna komplementarnega parjenja. Izbira je padla na dNaM in d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
En par sintetičnih nukleotidov je bil vstavljen v plazmid - dvoverižno krožno molekulo DNA, ki se lahko množi ločeno od preostalega genoma bakterij. Nadomestili so par komplementarnih nukleotidov A in T, ki sta bila del laktoznega operona - nabora genov, ki presnavljajo laktozni sladkor, in nekodirajočih zaporedij DNA, povezanih z njimi. Sintetični nukleotidi niso bili vključeni v regijo, ki jo polimeraza kopira v mRNA.
Promocijski video:
Zakaj so se znanstveniki odločili, da sintetičnih nukleotidov ne bodo vstavili neposredno v gen, temveč zraven? Dejstvo je, da je na ta način zelo težko spremeniti gen, da ostane funkcionalen. Konec koncev, za to morate nastale nove kodone vezati na katero koli aminokislino. Za to pa je treba celico naučiti proizvajati različne vrste transportne RNA (tRNA), ki lahko prepozna te kodone.
Molekule tRNA opravljajo naslednjo funkcijo. Tako kot tovornjaki imajo na enem koncu določeno aminokislino, se približajo mRNA v ribosomih in se nato začnejo ujemati trojko nukleotidov na drugem koncu s kodonom. Če se ujemata, se aminokislina odstrani in vključi v beljakovine. Če pa ni ustrezne tRNA, se protein ne bo sintetiziral, kar lahko negativno vpliva na sposobnost preživetja celic. Zato bi morali znanstveniki z uvajanjem sintetičnih nukleotidov v gene ustvariti gene, ki kodirajo nove tRNA, ki lahko prepoznajo umetne kodone in na polipeptid pritrdijo pravilno aminokislino. Vendar je bila naloga raziskovalcev enostavnejša. Poskrbeti so morali, da se plazmid s sintetičnimi nukleotidi uspešno razmnoži in prenese na hčerinske organizme.
Plazmidi, ki se uporabljajo za preoblikovanje Escherichia coli
Slika: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Narava / Oddelek za kemijo / Raziskovalni inštitut Scripps
Ta plazmid, imenovan pINF, je bil uveden v E. coli. Za kopiranje pa je nujno, da je v bakterijski celici veliko nukleotidov. V ta namen smo v E. coli vstavili še en plazmid, pCDF-1b. Vseboval je gen za diatom Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, ki kodira protein NTT, ki nukleotide prenaša iz hranilnega medija v celico.
Vendar pa so se znanstveniki soočali s številnimi težavami. Prvič, beljakovine Phaeodactylum tricornutum imajo toksičen učinek na celico E. coli. Vse zaradi prisotnosti fragmenta aminokislinskega zaporedja, ki ima signalno funkcijo. Zahvaljujoč njej beljakovine zavzamejo pravilen položaj v celici alge, nakar se zaporedje odstrani. E. coli tega fragmenta ne more odstraniti, zato so ji raziskovalci pomagali. Iz NTT so lahko odstranili prvih 65 aminokislin. To je znatno zmanjšalo toksičnost, čeprav je zmanjšalo tudi hitrost prenosa nukleotidov.
Druga težava je bila, da so se sintetični nukleotidi dolgo časa zadrževali v plazmidih in jih pri kopiranju DNK niso zamenjali. Izkazalo se je, da je njihova varnost odvisna od tega, kateri nukleotidi jih obkrožajo. Da bi to ugotovili, so znanstveniki analizirali različne kombinacije, vdelane v 16 plazmidov. Da bi razumeli, ali je sintetični nukleotid izpadel iz zaporedja, so raziskovalci uporabili tehnologijo CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Slika: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 je molekularni mehanizem, ki obstaja znotraj bakterij in jim omogoča boj proti bakteriofagom. Z drugimi besedami, ta tehnologija predstavlja imunost proti virusnim okužbam. CRISPR je poseben del DNK. Vsebujejo kratke drobce virusov DNA, ki so nekoč okužili prednike današnjih bakterij, a jih je notranja obramba premagala.
Ko bakteriofag vstopi v bakterijo, se ti fragmenti uporabljajo kot predloga za sintezo molekul, imenovanih crRNA. Nastane veliko različnih verig RNA, ki se vežejo na protein Cas9, katerega naloga je rezanje virusne DNA. To lahko stori šele potem, ko crRNA najde komplementarni fragment virusne DNA.
Če se namesto crRNA uporabi zaporedje RNA, komplementarno določenemu fragmentu plazmida, bo Cas9 razrezal tudi plazmid. Če pa so v tem fragmentu sintetični nukleotidi, potem beljakovine ne bodo delovale. Tako je s pomočjo CRISPR mogoče izolirati tiste plazmide, ki so odporni na neželene mutacije. Izkazalo se je, da je bila izguba sintetičnih nukleotidov v 13 od 16 plazmidov nepomembna.
Tako je raziskovalcem uspelo ustvariti organizem s temeljnimi spremembami v DNK, ki jih je lahko neomejeno zadrževal v sebi.
Čeprav ima polsintetična življenjska oblika v svojem genomu le dva nenaravna nukleotida, ki jih v kodonih ne najdemo in ne sodelujejo pri kodiranju aminokislin, je prvi odporni organizem, katerega abeceda DNA je sestavljena iz šestih črk. V prihodnosti bodo znanstveniki to inovacijo najverjetneje lahko uporabili za sintezo beljakovin in s tem ustvarili polnopravno umetno genetsko kodo.
Aleksander Enikeev