Vzorce tkiva mumij pod imenom "Maria" in "Vavita" so iz Perua poslali v ruski laboratorij na raziskovanje. Priskrbljeni vzorci bioloških tkiv so bili proučeni s pomočjo skenirajoče elektronske mikroskopije, Ramanovega spektra, ICPE, raziskali smo sestavo diatomejske zemlje (snovi na površini kože mumij). Opravljena je bila tudi študija DNK prenesenih tkiv.
Priprava vzorcev
Vzorce tkiv 500 μg smo prenesli v plastične epruvete in jih raztopili v 1 ml pufra (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). V nastale suspenzije smo dodali Na dodecil sulfat na 0,5%, segrevali na +80 ° C in po 10 minutah postavili proteinazo K (do 500 μg / ml) v termostat (+55 ° C) za 24 ur.
Deproteinizacijo smo izvedli po fenolni metodi: suspenziji dodamo fenol v enakem volumnu, nato fenol: kloroform (1: 1), kloroform; po vsakem dodajanju smo neprekinjeno mešali na kotnem rotorju in centrifugirali pri 15 tisoč vrtljajih, 10 minut.
Super-usedlini, dobljeni po 3. centrifugiranju, dodamo 1/10 dela volumna 1 M NaCl in 2,5 volumna dvakrat destiliranega etilnega alkohola in pustimo čez noč pri -30 ° C v koničnih epruvetah - "Eppendorf". Centrifugiranje je bilo izvedeno pri 15 tisoč vol. min. v 10 minutah in prejeli DNK "oborjeno" v obliki rjave oborine. DNK pelet smo dvakrat sprali z 70% etilnim alkoholom in posušili pri sobni temperaturi (1 h) ter nato raztopili v puferju TE.
PCR smo izvedli na programiranem termičnem kolesu "My Cycler" ("Bio = Rad") z uporabo standardnih oligoprimerjev, sintetiziranih po metodi trde faze pri združenju "Beagler" (Sankt Peterburg). Reakcijska zmes za amplifikacijo s prostornino 25 μL je vsebovala: 15 nM vsakega oligoprimera, 67 mM Tris-HCl pH = 8,8 pri +25 ° C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanol, 170 μg / ml BSA in mešanica štirih osnovnih dNTP v koncentraciji 1,0 mM vsakega in termostabilne DNA polimeraze Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Po denaturaciji (10 min, 94 ° C) smo za vsak preskusni sistem izvedli 35 amplifikacijskih ciklov: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Za nadzor specifičnosti so v reakcijo vnesli vzorce DNK z znanimi genotipi za preučene lokuse (markerje) in kontrolne vzorce.ki vsebuje mešanico reagentov brez DNK. Po amplifikaciji smo dodali obarvalni pufer v alikvote reakcijske mešanice (7 μl) in ga ločili z navpično elektroforezo v 6% poliakrilamidnem gelu (210x150x1 mm), obarvali z etidijevim bromidom in fotografirali pod ultravijolično svetlobo. Za identifikacijo alelov so bili uporabljeni alelni standardi, ki ustrezajo tem lokusom.
Promocijski video:
DNK analiza
Za raziskavo smo uporabili metodo analize exome človeške DNK, ki temelji na sekvenciranju z visokim pretokom z obogatitvijo s hibridizacijo.
Tehnika analize exome človeške DNK.
Analizirali smo 2 vzorca … Vse faze priprave vzorca pred PCR smo izvedli v čistih prostorih. Priprava vzorcev, ekstrakcija DNK in amplifikacija posameznih fragmentov DNK so bili izvedeni v različnih prostorih.
Specifični adapterji (komplet za pripravo knjižnice KAPA in komplet za prilagajanje SeqCap; Roche) so bili vezani na konce genomske fragmentirane DNK (~ 5 ng), po kateri je bil izveden dvostopenjski odlomki v dolžinskem območju 200-350 bp z uporabo AMPureXP kroglice (Beckman Coulter) … Nastale fragmente smo 28 ur amplificirali s prilagojenimi osnovnimi prameni in hibridizirali z biotiniliranimi specifičnimi sondami (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) 28 ur pri 47 ° C. V eni reakciji sta bila združena dva vzorca DNK. Biotinilirane hibride sonde-DNA smo izolirali in očistili s streptovidinskim konjugiranim magnetnim delcem; izvedli smo drugo amplifikacijo in kvalitativno oceno dobljene knjižnice DNK (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Da bi odstranili osipne fragmente ojačanja in prilagajalne dimere, smo DNK knjižnico ponovno očistili z uporabo magnetnih delcev AMPureXP Beads (slika 1). Končna koncentracija pripravljene knjižnice je bila ocenjena na instrumentu Quantus z uporabo komercialnega sistema QuantiFluor® dsDNA System (Promega). Nastalo DNK knjižnico imobiliziramo na površino pretočne celice. Sekvenciranje je bilo izvedeno na platformi Illumina z uporabo Standard Flow Cell in MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 ciklov). Nastalo DNK knjižnico imobiliziramo na površino pretočne celice. Sekvenciranje je bilo izvedeno na platformi Illumina z uporabo Standard Flow Cell in MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 ciklov). Nastalo DNK knjižnico imobiliziramo na površino pretočne celice. Sekvenciranje je bilo izvedeno na platformi Illumina z uporabo Standard Flow Cell in MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 ciklov).
Slika: 1
Splošna ocena kakovosti sekvencirane DNK
Za prvotno oceno kakovosti so bile uporabljene standardne metode, kot sta FastQC ter programa Jellyfish in KraTER. Ocena kakovosti ni pokazala težav s kakovostjo odčitavanja odsekane DNA za oba vzorca. Slike niso prikazane, ker niso informativne narave.
Za prvi vzorec (nadaljnja M, velika mumija "Maria") je bilo zaporednih 113,4M branja, za drugi vzorec (nadaljnja W, majhna mumija "WaWita") pa je bilo zaporednih 22,9M branja.
Naslednji korak je bil čiščenje zaporednih odčitkov iz različnih tehničnih zaporedij, ki bi motili nadaljnjo analizo. Za to je bil uporabljen program Cookiecutter. Po čiščenju je bilo za M in W odčitano 113,3 M (99%) in 22,8 M (99%).
Ocena količine starodavne DNK in njene ločitve od sodobne
Standardna metoda za oceno prisotnosti in količine starodavne DNK je ocena količine časovno poškodovanih nukleotidov. Za to je bil uporabljen program MapDamage 2.0. MapDamage 2.0, ki je pokazal količino starodavne DNK v 30,1%, ker pa MapDamage pomeni, da uporabljamo natančno referenco, in ne vemo natančno, kako blizu sta oba vzorca genomu sodobnih ljudi, in uporabili smo knjižnico exome, ta metoda sama po sebi ni bila zadostno. Druga dobra metoda za oceno starodavnih DNK je število kratkih fragmentov.
Filtracija domnevne starodavne DNK je potekala v treh fazah. Na prvi stopnji smo odstranili vsa seznanjena branja, ki jih ni mogoče prekrižati in sestaviti v eno neparino branje s prekrivanjem. Ta branja so nakazovala, da je bil prvotni fragment, ki je bil sekvenciran, daljši od 300 bp. in najverjetneje sodobni DNK. Tako je po tem koraku ostalo 86,9% oziroma 91,8%. Po tem so bili izbrani posamezni prekrivni fragmenti, tako da je bila njihova dolžina krajša od 150 bp, saj je to dolžina, ki smo jo pričakovali za starodavno DNK. Po tem koraku je za vzorca M in W ostalo 8,6% oziroma 38,5%. Upoštevati je treba, da je kljub razliki v odstotkih absolutno število odčitkov med vzorcema M in W zelo podobno: 9,8M in 8,8M, kar je mogoče razložiti z dejstvom, da vsebnost starodavne DNK v obeh vzorcih je podobna.
| Parameter | Vzorec M (Marija) | Vzorec W (Wawita) |
| Število prebranih | 113.3M | 22.8M |
| Odstotek kratkih fragmentov <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Odstotek kratkih fragmentov <150 bp (število) |
8,6% (9.846.035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Odstotek fragmentov, poravnanih na človeški genom (število) |
2,03% (2.345.084) |
9,65% (2,264,551) |
| Odstotek fragmentov, poravnanih na človeški genom, s kratkim <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Pridobitev DNK, podobnega referenčnemu človeškemu genomu
Tako dobljena domnevna starodavna DNK je bila preslikana na referenčni človeški genom s standardnim iskalnim cevovodom za gensko različico z uporabo BWA, samtools in Wcftools.
Poleg tega je bilo le 23,8% vzorca M in 25,6% uspešno preslikanih v referenčni genom sodobnih ljudi. Hkrati za oba vzorca 75% zaporednih odčitkov ni bilo mogoče preslikati na človeški genom. To je mogoče razložiti tako s kontaminacijo kot z dejstvom, da se ti vzorci nahajajo dovolj daleč od genoma sodobnega človeka. Hkrati je treba upoštevati, da smo sekvencirali knjižnico exome in s tem zmanjšali kontaminacijo bakterijske DNK.
Začetna izvidniška analiza neželenih branj je pokazala, da nekateri spadajo med ponavljajoče se DNK, značilne za kopitarje, kar je mogoče razložiti z dejstvom, da so pri mumifikaciji uporabljali maščobo iz lame.
Za natančnejšo analizo je potrebnih približno tri tedne izračunov, saj so bile obstoječe rešitve narejene samo za virusne in bakterijske genome, zato jih moramo primerjati z vsemi obstoječimi, vključno z rastlinskimi genoma, da bi razumeli, katere vrste so bile zaporedne.
Značilnosti najdenih možnosti
Preslikani odčitki so bili uporabljeni za iskanje variant, ki razlikujejo M in W vzorce od sodobnega človeškega genoma, pa tudi za oceno kontaminacije odčitkov iz človeškega Y kromosoma.
Prvo vprašanje, na katero je bilo treba odgovoriti, je bilo, na katere kromosome so preslikani zaporedni odčitki.
Ker vemo, da so bili Marijini vzorci izolirani iz kosti in mišic, Vavita pa samo iz kosti, smo pričakovali razliko v količini mtDNA. A razlike ni bilo veliko.
Število preslikanih preslikav na Y je še en test za kontaminacijo sodobnih ljudi. Zanimivo je, da se je v obeh vzorcih izkazalo enako.
Statistika najdenih variant je prikazana spodaj:
| Parametri | Vzorec M (Marija) | Vzorec W (Wawita) |
| Število najdenih možnosti | 79957 | 48941 |
| Število možnosti na Y | 534 | 541 |
| Število zanesljivih možnosti (več kot 20 odčitkov in več kot 30 kakovosti) | 16969 | 6181 |
| Variante z znanim rsidom (na voljo v zbirki podatkov) | 5701 | 3089 |
| Splošne veljavne možnosti | 92 | |
| skupne možnosti z rsidom | 49 |
Po tem je bilo mogoče odgovoriti na vprašanje: ali sta sorodnika M in W? Odgovor je ne.
Najdenih je bilo 49 ujemajočih se različic med M in W in 3040, ki se razlikujejo za različice z znanim rsidom. Še več, morda so to različne vrste ali podvrste osebe ali neznanega bitja.
Zanimivo je, da so različice z Y kromosomom za oba vzorca enake, kar kaže na kontaminacijo iste osebe in da v starodavni DNK kromosoma Y verjetno še vedno ni kromosoma.
Ocena podobnosti z obstoječimi sekvenciranimi človeškimi genomi iz projekta 1000 človeškega genoma
Upoštevajte, da gre le za približno analizo, saj so za natančnejšo analizo potrebne različice iz regij genoma pod nevtralno selekcijo in imamo podatke o eksomezih.
Kljub temu je bilo mogoče s 5708 različicami za M ali 3096 za S opraviti različico analize v primerjavi s podatki o 1000 človeških genoma.
Rezultat PCA analize na spodnji sliki je prekrivanje dveh slik za M in W, izračunano ločeno, saj je med M in W premalo skupnih možnosti za oceno razdalj med M in W.
Ocena podobnosti.
Kot vidite, ni nobene naključja pri nobeni skupini genov, razlikujejo se tudi med seboj. Vendar je treba upoštevati, da smo pri izbiri uporabili kodirne sekvence, zato je priporočljivo uporabljati različice pod nevtralnim izborom.
Kljub temu pa se rezultat PCA dobro ujema z ročnim preverjanjem različic, ki je pokazalo, da so podatki v neurejeni homozigoti, kar spet kaže, da so slike daleč od sodobnega človeškega genoma.
Zaključek
Žal smo bili omejeni na samo dva vzorca, ponavadi se pri tej vrsti analiz uporablja več, vsaj 3-10 vsaj nekako povezanih. Zato je treba nadaljevati raziskave z velikim številom vzorcev.
Hkrati lahko najverjetneje sklepamo, da vzorci DNK Marije in Vavite ustrezajo človeški DNK, vendar ne sovpadajo z DNK, ki nam je na voljo iz baze podatkov s 1000 ljudmi.
Avtorja poročila: Baranov V. S. in Aseev M. V. (Znanstveno-raziskovalni inštitut za porodništvo in ginekologijo, Oddelek za prenatalno diagnostiko), Glotov A. S. in Glotov O. S. (Državna univerza St. Petersburg), A. S. Komissarov (Inštitut za citologijo Ruske akademije znanosti, Center za genetsko bioinformatiko).
Gradivo, ki sta ga zagotovila Konstantin Georgievič Korotkov (doktor tehničnih znanosti, profesor, Univerza za informacijske tehnologije, mehaniko in optiko) in Dmitrij Vladislavovič Galetsky (kandidat medicinskih znanosti, I. P. Pavlov, prva Sankt Peterburška državna medicinska univerza).
Več o mamicah Nazca glej oznako: Nazca mumije.
