Izum urejevalnika genov CRISPR-Cas imenujemo revolucija v biologiji. Znanstveniki obljubljajo, da jo bodo uporabili za izboljšanje sort rastlin in pasem živali za kmetijstvo, za zdravljenje prirojenih genetskih bolezni pri ljudeh. Dopisnik RIA Novosti je šel pogledat, kdo in kako genom ureja.
Center za urejanje genomov Moskovske državne univerze se je odprl pred nekaj več kot letom dni - na kampusu. Srečuje me njegov direktor, doktor kemije Peter Sergiev, in medtem ko se vozimo v dvigalu, se malo posveti zgodovini genskega inženiringa.
Genom so že urejali. Toda za to je bilo težko ustvariti orodja, dolgo je trajalo in rezultat pogosto ni bil tak, kot smo želeli, «pravi.
V vivariju se Pyotr Vladimirovič preobleče v modra laboratorijska oblačila, mi dajo bel kombinezon za enkratno uporabo in prosijo, naj fotoaparat obrišem z alkoholom. Zdaj je Petr Vladimirovič videti kot kirurg, jaz pa kot laboratorijski asistent iz serije "CSI - kraj zločina".
V sterilnem laboratoriju so za nas pripravili posodo z oplojenimi mišjimi jajci in epruveto z raztopino RNA. To je vse, kar potrebujete za urejanje genoma CRISPR-Cas.
CRISPR je angleški kratica za besedno zvezo, ki dobesedno pomeni "redno združene kratke palindromske ponovitve". V resnici so to le majhni odseki DNK bakteriofagnih virusov, vgrajenih v bakterijski genom. Ta zaporedja so potrebna, da bakterijski imunski sistem deluje, in služijo kot nekakšna napoved za "policijo, ki jo želijo". Če bakterija preživi po okužbi z bakteriofagom, s pomočjo encimov proteina Cas odreže delček svoje DNK in ga vstavi v svoj genom za kasnejše prepoznavanje. Bakterijski genom podeduje to knjižnico »sovražnikov«, ki so jih skrbno zbirale prejšnje generacije.
Leta 2013 so znanstveniki ugotovili, da protein Cas deluje v katerem koli organizmu, vključno s sesalci. Sposoben je narediti smerne prelome na obeh nizih molekule DNK in tako spremeniti genom.
Promocijski video:
Manipulacija z jajci
Petr Sergiev naredi mikro steklo stekleno kapilaro s premerom sto mikronov, vanjo vleče jajce in ga s hranilnim medijem prenese pod steklo. Končani vzorec se pošlje na stopnjo optičnega mikroskopa. Monitor prikazuje povečano sliko jajčeca, ki se trese na vrhu kapilare. Izstopata dve zaobljeni piki - to sta pronuklei z DNK matere in očeta.
Znanstvenik pripravi še en kapilar z vrstnim redom manjšega premera. To je injekcijska brizga. Vanj nabere raztopino z dvema vrstama RNA in s pomočjo manipulatorjev nežno preluknja jajce. To je to, injekcija je narejena.
RNA, ki se vbrizga v jajce, je potrebna za rezanje genoma na določeni lokaciji. Ena vrsta RNA vsebuje strogo določeno zaporedje nukleotidov, podobno tistemu, ki smo ga želeli spremeniti. Naloga te RNK je najti ustrezno regijo v DNK, zato se imenuje "vodnik". RNA drugega tipa, matriks, je nekakšno navodilo za sintezo proteina Cas9 nukleaze. Ta protein deluje kot katalizator za kemično reakcijo, ki prekine fosfodiesterske vezi med dobro določenimi DNK bazami. Ker ima molekula proteina dva nukleazna centra, se obe verigi DNK odpirata tudi na mestu, katerega koordinate je Cas9 "štel" z vodilno RNA.
Molekul DNK lom v obeh nizih dojema kot resen razpad in ga poskuša popraviti. Encimi, ki plavajo v celici, takoj odstranijo več nukleotidov z obeh koncev zloma. To je dovolj, da zlomimo ali, kot pravijo genetiki, "izklopimo" gen.
Kako deluje genomski urednik CRISPR-Cas9 / Ilustracija RIA Novosti. Alina Polyanina.
Če je potrebna na primer usmerjena mutacija, da je treba beljakovine označiti, da jih lahko sledimo v telesu, potem dvema RNK v kompleks dodamo drugo šablono v obliki posebej zasnovane DNK. Sestavljen je iz zaporedij, enakih robom prihodnjega preloma, in vsebuje tudi odsek, ki ga je treba vstaviti. Potem ko je Cas9 prerezal molekulo DNK, se njeni konci povežejo s to dodatno šablono, tako da v prelom vstavimo nabor nukleotidov, ki jih potrebujemo.
Na veverico lahko pritrdimo majhen rep, s katerim je priročno, da jo izvlečemo in vidimo, s čim se ukvarja. Lahko vstavimo gen, vendar ni tako učinkovit, kot da ga izklopimo, «še naprej razlaga znanstvenik.
GSO in himere
Urejeno jajce bo presadjeno v maternično cev nadomestne miške. Nekaj časa je živela z moškim, katerega polprepletene tubule so bile vezane. Par je imel normalno spolno življenje, a ni mogel zanositi. Kljub temu je mišje telo verjelo, da je noseča, in oblikovalo je zanjo primerno hormonsko ozadje. Zdaj ta samica rodi nekoga drugega.
Čez tri tedne bo rodila navadne miši. Znanstveniki bodo počakali, da glodalci odrastejo, jim odvzeli majhen košček repa in uporabili PCR za analizo koščka DNK, ki so ga uredili. Mutacijo ali onesposobljen gen najdemo v več kot polovici primerov. Z obratnim postopkom - vstavitvijo zaporedja v genom - uspe v največ 10% poskusov.
Pri urejanju se pojavijo različni zanimivi učinki. Na primer, rodijo se mozaične miši ali himere, ki imajo celice z različnimi spremembami materinih in očetovskih genomov. Cas9 lahko večkrat razreže DNK, toda sporočilna RNA, ki ga kodira, ni večna, injicirana raztopina pa preprosto izgine v vrsti delitev celic. Včasih se urednik še vedno sproži, potem ko se pronukleusi zlijejo in jajce razdeli. In ker je popravljanje DNK po rupturi vedno naključen proces in zdravljenje se nikoli ne zgodi na enak način, bodo nekatere celice v enem organizmu vsebovale drugo mutacijo.
Za znanost in medicino
Prestavimo se v sosednjo sobo in si ogledamo rezultate rezultatov eksperimentov urejanja genomov. Na policah na levi - posode z gensko spremenjenimi mišmi, na desni - s skupnimi glodalci za zatiranje. Odrasli so bili, kot tisti na levi, vendar z genomom niso manipulirali. Kontrolne miši so potrebne, da imamo normo pred našimi očmi in primerjamo bitja, pridobljena v poskusu, z njo.
Pyotr Sergiev vzame eno od posod s pari sivih miši. Navzven so povsem običajni, vendar nimajo potomcev. Dejstvo je, da je pri moškem izključen gen ene od RNK metiltransferaz, encima, ki nastaja samo v spermi. Moški z neaktivnim genom se rodijo sterilno. Natančen namen gena in encima še ni znan. Da bi ugotovili, sta bila v laboratoriju vzrejena dva seva miši: eden je imel izključen gen, drugi pa protein, ki je bil označen z genskim urejevalnikom.
»Mutacija tega gena najdemo tudi pri ljudeh - takrat moški trpi za neplodnostjo. Toda dokler ne ugotovimo, zakaj je ta potreben, zakaj spreminja RNA, takim bolnikom ne bomo mogli pomagati, «razlaga znanstvenik.
Pravzaprav še vedno ne poznamo funkcije večine človeških genov. Ugotovitev tega je temeljna naloga, ki jo rešujejo številne raziskovalne skupine po vsem svetu, tudi v Rusiji. Mišji genom je zelo podoben človeškemu. Upati je, da bo s pomočjo CRISPR-Cas preučevanje genoma katerega koli bitja potekalo hitreje.
Sergijeva skupina skupaj z N. N. NN Petrova se je lotila iskanja mutacij, ki vodijo do nekaterih vrst raka. Najbližji načrti vključujejo projekt za ustvarjanje gensko spremenjenih živali za kmetijstvo v sodelovanju z Vseslovenskim raziskovalnim inštitutom za rejo živali in Inštitutom za gensko biologijo Ruske akademije znanosti.
„CRISPR-Cas je fantastično orodje, ki vam omogoča, da spremenite genom po lastni presoji, da postanete malo božji. Naloga znanosti je navsezadnje razumeti, kako deluje tako zapleteno bitje, kot je sesalec, «pravi znanstvenik.
Reševanje temeljnih problemov znanosti je super, a kaj bo ta tehnologija dala medicini? V bližnji prihodnosti, žal, ne veliko. Jajce je enostavno urediti in vzgojiti gensko spremenjeno miško, vendar ni mogoče popraviti genov odrasle živali, kaj šele človeka.
Metode urejanja DNK v somatskih (torej že oblikovanih celicah) so še vedno zelo neučinkovite. Če želite v celico vnesti nekaj gena, ki je bil izključen z mutacijo, in ga prisiliti, da proizvaja določen protein, morate nekaj celic odstraniti iz telesa, v njih urediti DNK in ga vstaviti nazaj v telo. Načeloma obstaja upanje, da se bo na ta način mogoče boriti proti boleznim, kot je Duchennova mišična distrofija ali cistična fibroza, ko je treba obnoviti delovno zmogljivost nekaterih delov celic. Kar zadeva nagnjenost k raku, je zaenkrat genski urejevalnik brez moči. Če v človeku najdemo mutirani gen, potem ga najdemo v vseh celicah telesa. Nerealno jih je vse spremeniti. In vsaka celica z mutacijo predstavlja nevarnost.
A četudi bo CRISPR / Cas pomagal odgovoriti le na nekaj temeljnih vprašanj in omogočil zdravljenje redkih genetskih bolezni, bo to še vedno velik korak naprej za človeštvo.
Tatjana Pichugina