Genski inženiring človeštvu odpira možnosti za ustvarjanje prej neobstoječih organizmov in uničenje genskih bolezni. Stvari pa niso tako rožnate, saj niti prebojna tehnologija CRISPR / Cas9 še zdaleč ni popolna. Napake, ki jih naredi, so sicer redke, a ena je dovolj, da postane človeku usodna. Lenta.ru govori o tem, kaj je narobe s CRISPR in kako poskušajo znanstveniki urediti situacijo.
Sistem CRISPR / Cas9 - neke vrste škarje za DNA - upravičeno velja za revolucijo na področju genskega inženiringa. Z njegovo pomočjo lahko znanstveniki urejajo človeški genom, odstranjujejo iz njega škodljive mutacije in tako zdravijo neprijetne in smrtonosne dedne bolezni. Ne smemo pa pomisliti, da prej takšnih metod ni bilo. V arzenalu genetikov so bile na primer nukleaze, ki vsebujejo cinkove "prste", in endonukleaze - encimi, ki na določenih mestih razbijajo molekule DNA. Po natančnosti, vsestranskosti in ceni so opazno slabši od CRISPR / Cas9, čeprav slednji še zdaleč ni popoln.
CRISPR / Cas9 prvotno niso ustvarili znanstveniki, temveč narava. To je molekularni mehanizem znotraj bakterij, ki jim omogoča boj proti bakteriofagom in drugim parazitom. Dejansko deluje kot imunost proti okužbam. CRISPR (kratice za "kratke palindromne ponovitve, redno razporejene po skupinah") so posebna področja (lokusi) DNA. Vsebujejo kratke drobce virusov DNA, ki so nekoč okužili prednike današnjih bakterij, a jih je notranja obramba premagala. Ti deli se imenujejo distančniki in so med seboj ločeni s ponavljajočimi se zaporedji.
Ko bakteriofag napadne bakterijo, se vsako ponavljajoče se zaporedje in sosednji distančnik uporabijo kot predloga za sintezo molekul, imenovanih crRNA. Nastane veliko različnih verig RNA, ki se vežejo na protein Cas9, katerega naloga je zelo preprosta: razrezati DNA virusa. Vendar bo to lahko storil šele potem, ko bo crRNA našla komplementarni fragment virusne DNA. Ko Cas9 razgradi tujo nukleinsko kislino, jo druge nukleaze popolnoma uničijo.
CRISPR / Cas9 je dober ravno zaradi svoje natančnosti, saj je za bakterije pravilno delovanje imunskega sistema stvar življenja in smrti. "Protivirusni" sistem mora med milijonom drugih najti del virusne DNA in, kar je najpomembneje, ne zamenjati ga z lastnim genomom. V milijonih let evolucije so bakterije ta mehanizem izpopolnile. Tako so takoj, ko so ugotovili, zakaj je potreben sistem CRISPR, ugotovili, da ga je mogoče ukrotiti kot izjemno natančno orodje za urejanje genov.
Za zamenjavo ene določene regije v genomu z drugo je treba sintetizirati vodilno RNA, ki je načeloma podobna crRNA. Cas9 pove, kje je treba narediti dvoverižni prelom v DNA spremenjenega organizma. Vendar nam gena ni treba pokvariti, temveč ga spremeniti - na primer nadomestiti enega ali več nukleotidov in odstraniti škodljivo mutacijo. Tu narava spet priskoči na pomoč. Naravni mehanizmi za popravilo takoj začnejo obnavljati prerezano verigo. Trik je v tem, da se za to nekatere fragmente RNA odstranijo blizu preloma, nato pa se tam vstavijo podobna zaporedja. Znanstveniki jih lahko nadomestijo z lastnimi zaporedji DNK in tako spremenijo genom.
Shematski prikaz CRISPR
Promocijski video:
Slika: Kaidor / Wikipedia
Vendar nič ni popolno. Kljub svoji relativni natančnosti CRISPR včasih dela napake. Eden od razlogov je v sami naravi sistema. Pri bakterijah za rRNA je neugodno, da 100-odstotno sovpada s fragmentom virusne DNA, ki se lahko razlikuje za en ali dva nukleotida. Zanjo je bolje, da so nekateri nukleotidi lahko drugačni, kar daje mikroorganizmu večje možnosti za boj proti okužbi. Hkrati pri genskem inženiringu nizka specifičnost grozi z napakami: spremembe se lahko izvedejo na napačnem mestu. Če se to zgodi med poskusi na miših, posebne tragedije ne bo, urejanje človeškega genoma pa se lahko spremeni v katastrofo.
To pojasnjuje zaskrbljenost zahodnih znanstvenikov glede poskusov, ki jih izvajajo na Kitajskem. Azijski raziskovalci so s tehnologijo CRISPR genetsko spremenili človeške zarodke. Takšni poskusi so v Evropi in ZDA prepovedani, v zadnjem času pa jih je Združeno kraljestvo dovolilo - izključno v raziskovalne namene. Takšne zarodke bo treba uničiti v nekaj tednih po prejemu, kar izključuje "vzrejo" gensko spremenjenih ljudi.
Vendar CRISPR / Cas9 ne bi bil tako dober, če ga ne bi bilo mogoče izboljšati. Znanstveniki so torej Cas9 naučili, da ne sme prerezati dveh verig hkrati, ampak samo eno. Rez je narejen na dveh različnih mestih v zaporedju DNA na različnih verigah, zato mora biti sistem sposoben prepoznati dvakrat toliko nukleotidov kot običajno, zaradi česar je natančnejši.
Beljakovine Cas in crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Znanstveniki z Univerze v Zahodnem Ontariju so našli še en način za izboljšanje te tehnologije. Poskušali so rešiti problem popravila odrezane DNK. Hitra obnova verige nukleinske kisline vodi do dejstva, da znanstveniki nimajo časa, da bi sami popravili genom. Tako se ustvari začaran krog: verigo, ki je popravljena na neželen način, je treba ponovno prerezati z beljakovino Cas9.
Da se to ne bi zgodilo, so raziskovalci modificirali proteinske škarje, da bi ustvarili protein TevCas9. Na dveh mestih prereže verigo DNA, kar otežuje popravilo mesta. Za sintezo novega encima je bil v Cas 9 dodan encim I-Tevl, ki je hkrati tudi endonukleaza, torej protein, ki v sredini cepi molekulo DNA, namesto da bi odcepil konce zaporedja, kot to počnejo eksonukleaze. Nastali fuzijski protein se je izkazal za natančnejšega pri vezavi na določena mesta in manj verjetno, da bo naredil napako in razrezal napačno mesto.
Kristalna struktura Cas9, vezana na DNA
Foto: projekt wi9 Cas9 / Wikipedia
Obstaja še en način za izboljšanje natančnosti sistemov CRISPR. "Dirka orožja" med bakterijami in virusi ni pripeljala le do razvoja obrambnih sistemov v mikroorganizmih, temveč tudi do načinov njihove nevtralizacije. Tako bakteriofagi hitro mutirajo in izgubijo področja, po katerih jih prepozna bakterijska imunost. Vendar pa nekaj kode za proteine anti-CRISPR, ki ovirajo delo kompleksa crRNA-Cas9.
Časopis Cell je 8. decembra objavil članek znanstvenikov z univerze v Torontu, ki so ustvarili "anti-CRISPR" - sistem, ki vam omogoča izklop mehanizma pod določenimi pogoji. Preprečuje neželene napake z zatiranjem aktivnosti Cas9 v primeru, da se vodilna RNA veže na napačen fragment. Anti-CRISPR je sestavljen iz treh beljakovin, ki zavirajo nukleazo in jih kodirajo geni enega od bakterijskih virusov.
Tehnologija CRISPR se že uporablja za zdravljenje resnih bolezni, kot sta levkemija in pljučni rak, testirajo pa jo tudi za čiščenje virusa HIV iz imunskih celic. Ko bodo znanstveniki našli nove načine za izboljšanje te metode, se bo odpiralo vedno več možnosti za njeno uporabo.
Aleksander Enikeev