Znanstveniki veliko upajo na tehnologijo CRISPR / Cas9, ki omogoča zelo natančne spremembe v genomih živih organizmov, vključno z ljudmi. Objavljeni so vsi novi znanstveni članki, ki opisujejo različne vrste sistemov CRISPR in njihove modifikacije. "Lenta.ru" govori o odkritjih na tem področju leta 2016.
Na tisoče jih
CRISPR / Cas9 je bakterijski prilagodljivi imunski sistem, ki mikroorganizmom omogoča boj proti virusom. Sestavljen je iz distančnikov - odsekov DNA, ki ustrezajo določenim fragmentom (protospacers) DNK okužbe. Distančniki kodirajo specifične molekule crRNA, ki se vežejo na encim Cas9. Nastali kompleks se pritrdi na verigo DNA virusa, Cas9 pa deluje kot škarje in ga reže.
Pravzaprav je CRISPR / Cas9 le eden izmed mnogih podobnih sistemov, ki jih imajo bakterije in arheje. Znanstveniki jih razdelijo v dva razreda. Prvi razred vključuje sisteme CRISPR tipa I, III in IV, drugi - II in V. Tip II vsebuje protein Cas9, ki sodeluje pri pridobivanju novih distančnikov, kopičenju crRNA v celici in cepitvi DNA. V drugih sistemih se v te namene uporabljajo večproteinski kompleksi. Zaradi tega je tip II najpreprostejši tip sistema CRISPR, primeren za potrebe genskega inženiringa.
Vrste se lahko nato razdelijo na podtipe, odvisno od tega, kateri dodatni geni so povezani s CRISPR. Na primer, sistemi IIA vsebujejo gen csn2, ki kodira protein, ki se veže na DNA in sodeluje pri pridobivanju distančnikov. V sistemih IIB csn2 ni, obstaja pa gen cas4, katerega funkcija še vedno ni znana, sistemi IIC pa nimajo ne csn2 ne cas4.
Zakladi znotraj bakterij
Promocijski video:
Vse znane sisteme CRISPR so znanstveniki odkrili v bakterijah, gojenih v laboratorijskih pogojih. Obstaja pa ogromno gojenih mikroorganizmov, med katerimi so tako arheje kot bakterije. Običajno živijo v ekstremnih razmerah - mineralnih izvirih ali strupenih vodnih telesih v zapuščenih rudnikih. Vendar pa lahko raziskovalci od njih izolirajo DNK in v njem prepoznajo določene regije. V novem prispevku, objavljenem v reviji Nature 22. decembra, so genetiki s Kalifornijske univerze Berkeley dekodirali genom iz naravnih mikrobnih skupnosti in odkrili druge različice sistema CRISPR.
Bakteriofag - virus, ki okuži bakterije
Slika: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Znanstveniki so uspeli ugotoviti, da imajo nekatere vrste malo preučevanih arheom podobnih nanoorganizmov ARMAN tudi CRISPR / Cas9, čeprav so prej verjeli, da jih imajo le bakterije. Opozoriti je treba, da ta sistem zaseda vmesno mesto med podtipom IIC in IIB in lahko služi kot obramba pred parazitskimi "skakalnimi" geni (transpozoni), ki vstopajo v mikroorganizem iz drugih arhej. Poskus reprodukcije aktivnosti arhealnega CRISPR / Cas9 pri E. coli (Escherichia coli) ni privedel do ničesar, kar kaže na obstoj nekaterih dodatnih posebnih mehanizmov, ki uravnavajo sistem.
Tudi nove vrste sistemov v drugem razredu, CRISPR / CasX in CRISPR / CasY, so bile ugotovljene tudi pri bakterijah, ki živijo v podtalnici in usedlinah. Sistem CRISPR / CasX vključuje beljakovine Cas1, Cas2, Cas4 in CasX. Slednjo, kot kažejo poskusi na E. coli, odlikuje nukleazna aktivnost, to je, da je sposoben cepiti tujo DNA kot Cas9. Vendar se to zgodi le, če je zaporedje TTCN pred protoprostori, kjer je N kateri koli od štirih nukleotidov. Takšna zaporedja se imenujejo PAM (protospacer sosednji motiv - motiv sosednji protospacer). Sistem CRISPR / Cas9 ima tudi svoj PAM - NGG, ki naj bi bil nameščen za protospacerjem. Poleg tega lahko CRISPR / CasY razreže DNA, če je v bližini ciljne strani zaporedje TA PAM.
Kaj je obljuba tega odkritja? Dejstvo je, da so zaznani sistemi trenutno najbolj kompaktni. Po mnenju znanstvenikov je zaradi majhne količine beljakovin, potrebnih za njihovo delo, CRISPR / CasX in CRISPR / CasY priročna orodja za urejanje DNK. Poleg tega bodo metagenomske študije, v katerih se preučuje DNK, pridobljena iz okolja, razkrile druge vrste sistemov CRISPR, ki so koristni za genski inženiring.
Pot do odličnosti
Seveda obstaja alternativa iskanju sistemov CRISPR v naravi - izboljšanje že obstoječe tehnologije CRISPR / Cas9. Kljub svoji visoki natančnosti dela napake z rezanjem DNK na napačnem mestu. To otežuje pravilne spremembe genov in s tem učinkovito zdravljenje dednih bolezni. Zato znanstveniki iščejo načine za izboljšanje učinkovitosti sistema. Leta 2016 je bilo veliko znanstvenih del, namenjenih spreminjanju CRISPR in njegovemu spreminjanju v različna genska orodja.
Beljakovine Cas9 in crRNA - glavni sestavni deli sistema CRISPR
Slika: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Tako je revija Cell 8. decembra objavila članek znanstvenikov z univerze v Torontu, ki so ustvarili "anti-CRISPR" - sistem, ki pod določenimi pogoji izklopi mehanizem. To vam omogoča zatiranje aktivnosti Cas9, če se vodilna RNA veže na napačen fragment in prepreči napake. Anti-CRISPR je sestavljen iz treh proteinov, ki zavirajo nukleazo. Seveda ga sprva niso izumili znanstveniki, temveč virusi, ki so tako nevtralizirali imunost bakterij.
Junija so ameriški raziskovalci skupaj s kolegi iz Rusije potrdili, da lahko sistem CRISPR / C2c2, pridobljen iz fusobacterium Leptotrichia shahii, reže enoverižno RNA. Posledično lahko sistem CRISPR uporabimo za izločanje - zatiranje funkcij - messenger RNA, ki prenaša informacije od genov do ribosomov, kjer se na njegovi osnovi sintetizirajo beljakovine.
Maja so raziskovalci na kalifornijski univerzi ustvarili CRISPR-EZ, tehnologijo, ki omogoča skoraj 100-odstotno uspešnost vstavljanja novih molekul DNA v genom mišičih zarodkov. Sistem CRISPR / Cas9 vnesemo v oplojena živalska jajčeca z mikroskopsko iglo in majhnim električnim praznjenjem. V svojem eksperimentu je znanstvenikom uspelo uvesti mutacijo gena pri 88 odstotkih miši. To presega število gensko spremenjenih miši, proizvedenih z urejanjem CRISPR, ki uporablja običajne injekcije.
Aprila so molekularni biologi na Medicinski fakulteti Univerze v Massachusettsu z uporabo mutirane različice Cas9, ki nima nukleazne aktivnosti, razvili tehnologijo CRISPRainbow. Vodilo RNA, ki označuje, kje se encimi vežejo, je vsebovalo fluorescentne oznake, kar omogoča, na primer, sledenje gibanju mobilnih genskih elementov.
Komar Anopheles je lahko prva žrtev sistemov CRISPR
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Pogumen nov svet
Znanstveniki že uporabljajo sisteme CRISPR za ustvarjanje gensko spremenjenih organizmov, kot so malarijski komarji, ki širijo škodljive gene med svojimi divjimi sorodniki. Ta metoda se imenuje genski pogon. Če je bil eden od staršev posameznika nosilec mutirajočega gena, ga bo s 50-odstotno verjetnostjo prenesel na svoje potomce. To je zato, ker ima starš dve kopiji gena in je le ena okvarjena. CRISPR lahko kopira mutantni fragment in ga vstavi v zdrav gen. Posledično potomci dobijo mutacijo s 100-odstotno verjetnostjo.
Leta 2016 so strokovnjaki Svetovalnega odbora za rekombinantno DNA (RAC) odobrili prošnjo Univerze v Pensilvaniji za izvajanje testov na genskih modifikacijah človeka s tehnologijo CRISPR / Cas9.
Vendar so jih prehiteli Kitajci. Novembra je revija Nature poročala, da so kitajski znanstveniki človeku prvič vnesli celice z geni, ki jih je spremenil sistem CRISPR / Cas9. Raziskovalci so iz krvi bolnika z metastatskim pljučnim rakom ekstrahirali imunske celice (T-limfocite) in nato s tehnologijo CRISPR izklopili gen, ki kodira protein PD-1. Dokazano je, da slednji zavira imunost s spodbujanjem rasti tumorja. Znanstveniki so gojili urejene celice, povečali njihovo število in jih nato vbrizgali nazaj v človeško telo. Ali se bo genska terapija spopadla z boleznijo, bomo še videli.
Sistemi CRISPR se lahko uporabljajo tudi za boj proti HIV in dednim boleznim ljudi. Za razvoj učinkovitega zdravljenja pa so potrebne nadaljnje raziskave. Seveda ne govorimo o mutantih, kot v znanstvenofantastičnih filmih, vendar bodo znanstveniki lahko hitro ustvarili gensko spremenjene organizme, na primer kmetijske rastline z odpornostjo na zajedavce. Treba je še ugotoviti, zakaj znanstveniki, ki so odkrili CRISPR in ugotovili, kako bi ga lahko uporabili, še niso prejeli Nobelove nagrade.
Aleksander Enikeev